Moleküler biyolojide, iyi tampon seçimi ve farklı DNA izolasyon aşamaları için hazırlık, protein ekspresyonuna geçme veya baştan başlamak için başka bir maxi-hazırlık kiti açmak arasındaki fark olabilir. Önemli öneme sahip olmalarına rağmen, tampon tarifleri genellikle sadece budur - farklı bileşenler için açıklama veya gerekçe olmadan yazılmış tarifler. Böyle bir tampon, glukoz-tris-EDTA veya GTE tamponudur.
$config[code] not foundGTE Nedir?
GTE, hücrelerin lize edilmesinden (açılmasından) ve içindeki plazmid DNA'sının toplanmasından önce bakteri hücre topaklarını yeniden süspanse etmek için kullanılır. Hücre zarlarını yumuşatan lizozim, genellikle GTE tamponu ile birlikte eklenir. Bu aşama sırasında bütün hücrelerin homojen bir süspansiyonunun elde edilmesi, böylece daha sonra eklenen lizis çözeltisi tüm hücrelere ulaşabilir, iyi DNA verimleri elde etmenin anahtarıdır. GTE, DNA için kararlı bir ortam sağlarken bunu yapmak için tasarlanmıştır.
Osmolarite için Glikoz
Hücreler dışındaki çözünen konsantrasyonun hücrelerin içindekilere yakın olduğu yerlerde ozmolariteyi korumak için GTE tamponuna 50mM (millimolar) glikoz şekeri eklenir. Bu, topaklanma ve bozulmaya bağlı olarak düşük DNA verimine neden olabilecek erken hücre parçalanmasını önler. Tamponun diğer bileşenleri de çözeltinin ozmolaritesine katkıda bulunur, ancak elektrolit olmayan glikoz, çözeltinin tampon özelliklerine müdahale etmediğinden iyi bir seçimdir.
PH Kararlılığı için Tris
Tris, çok yaygın bir pH tamponu olan tris (hidroksimetil) aminometan'ın kısa adıdır. GTE tamponu durumunda, asit tuzu (Tris-HCl), 25 mM'lik bir konsantrasyonda tampona eklenir. Bu, çözeltinin pH'ını, yakın bir fizyolojik 8.0'da muhafaza eder; plazmid DNA'nın asit hidrolizini (bozulmasını) ve diğer hücre bileşenlerinin istenmeyen yan reaksiyonlarını önlemek için ideal bir pH.
EDTA DNA bozulmasını önler
EDTA veya etilendiamintetraasetik asit, çözeltiden metal iyonlarını yakalar veya "şelatlar" yaparak istenmeyen yan reaksiyonlara katılmalarını önler. GTE tamponunda, EDTA 10 mM'de eklenir. Birincil amacı, serbest çinko, magnezyum ve kalsiyumu yuvarlamak ve böylece bu metalleri gerektiren belirli yollarla DNA bozulmasını önlemek için tampondadır.
Bazı önemli ipuçları
GTE tamponunuzu soğuk tutun ve içinde istenmeyen bakteri üremesini önlemek için küçük miktarlarda yapın. Şeker ve kontrollü pH, mükemmel bir büyüme ortamı sağlar. Her zaman saf su kullanın. Musluk suyu, EDTA'nın yakalama kabiliyetini etkileyebilecek olan borulardan fazla miktarda metal iyonuna sahip olabilir. Örneğinizde karışan RNA varlığından şüpheleniyorsanız, sorunu gidermek için GTE tamponunuza mililitre başına 100 mikrogramda RNase A ekleyin.
